​Anal. Chem. | 纳米酶传感器阵列

Anal. Chem. | 纳米酶传感器阵列

传统的生物传感器都是基于分析物与信号分子的特异性识别作用，例如抗原和抗体，天然酶和底物。这种方法需要合成对分析物特异响应的信号分子，检测效率低，难以对多种分析物同时检测和区分。近年来，传感器阵列已成为对多种分析物进行检测和识别的有力手段。类似于哺乳动物的嗅觉系统，传感器阵列具有多个交叉响应的传感元件，能够对每个分析物产生独特的复合响应，这些响应的数据阵列在多维数据分析工具（例如线性判别分析，LDA）下，可以产生对应不同分析物的特征点簇，也被称为“指纹图”。1-2

图1. 类似于哺乳动物的嗅觉系统，传感器阵列对不同物质产生复合响应，通过数据分析产生“指纹图”3

基于纳米酶价格低廉、稳定性好等优势，可以将纳米酶作为传感元件，构建纳米酶传感器阵列，应用于对生物分子、肿瘤细胞、金属离子、农药等物质的检测。例如Rotello和Zhang课题组利用具有类过氧化物酶活性的Fe3O4构建了比色型传感器阵列，用于蛋白质的检测。分别用多巴胺和三甲胺修饰Fe3O4纳米颗粒，作为传感元件，基于不同蛋白对不同配体修饰的Fe3O4纳米酶活性抑制能力的差异，该传感器阵列能够实现对50 nM的十种蛋白质的区分。4

本文主要介绍南京大学魏辉教授课题组在纳米酶传感器阵列方面的相关成果。

秦溧等人利用二维金属有机框架（2D-MOF）Zn-TCPP(Fe)、Co-TCPP(Fe)和Cu-TCPP(Fe)构建了三通道的比色型传感器阵列，用于检测人体内常见的五种磷酸盐（AMP、ADP、ATP、PPi以及Pi）。这三种2D-MOF材料都具有类过氧化物酶活性，能够催化H2O2和邻苯二胺（OPD）反应显色。由于2D-MOF结构中作为连接结点的金属离子与磷酸盐的配位作用强于与TCPP(Fe)中羧基的配位作用，因此加入磷酸盐会使得2D-MOF的结构崩塌，从而抑制材料的类过氧化物酶活性。由于不同磷酸盐与2D-MOF材料中金属离子的配位能力不同，对二维MOF材料的类过氧化物酶活性的影响也不同，因此利用这一性质可以构建纳米酶传感器阵列，对五种磷酸盐进行检测。在2 μM至500 μM的范围内，该传感器阵列对同浓度下的磷酸盐成分有很好的鉴别区分效果。该传感器阵列还能够区分不同配比的混合磷酸盐，能够在胎牛血清（FBS）环境中实现对不同磷酸盐的区分。此外，利用钼蓝比色定磷法，可以得到样品的含磷量，结合传感器阵列对同一磷浓度下的指纹图，能够实现对未知样品的检测。基于传感器阵列对ATP、ADP和AMP三者之间以及PPi和Pi二者之间的有效区分，可以很好地监测ATP以及PPi催化水解反应的进行程度（如图2）。5

图2. 2D-MOF纳米酶传感器阵列监测水解反应5

王小宇等人制备了三种具有类过氧化物酶活性的C3N4基纳米酶（C3N4-Ru，C3N4-Cu和C3N4-hemin）。当激发波长为385 nm时，这些C3N4基纳米酶的能够在438 nm处发射荧光。在H2O2和OPD存在时，C3N4基纳米酶可以催化H2O2氧化OPD而生成OPDox。OPDox一方面能够在385 nm的激发下在564 nm处发射荧光，另一方面能够淬灭C3N4基纳米酶本身的荧光。在564 nm的荧光强度（F564）与438 nm处的荧光强度（F438）之间的比值随着OPDox的生成量增加而增强。基于磷酸盐对三种C3N4基纳米酶活性的抑制，构建了比率型荧光纳米酶传感器阵列，同样用于五种磷酸盐的检测（如图3）。该比率型荧光传感器阵列具有比上一工作中的比色型传感器阵列更好的鲁棒性，能够进一步对1 μM的磷酸盐成分有很好的鉴别区分效果，而且同样能够区分不同配比的混合磷酸盐，能够在FBS环境中实现对不同磷酸盐的区分。6

图3. C3N4基纳米酶构建的比率型荧光纳米酶传感器阵列用于磷酸盐的检测的原理图6

此外，基于磷酸盐对2D-MOF类过氧化物酶活性的抑制，王小宇等人利用比色法实现了碱性磷酸酶（ALP）的检测。磷酸盐PPi、ADP和ATP能够明显抑制Zn-TCPP(Fe)的活性，而经过ALP催化作用后，这些磷酸盐的水解产物Pi对Zn-TCPP(Fe)的活性抑制效果很弱，因此能够建立吸光度变化值与ALP的含量的对应关系。通过改变磷酸盐的种类，能够获得可变的ALP检测范围，以PPi、ADP和ATP为底物得到的ALP检测范围分别是2.5-20 U/L、50-200 U/L和5-60 U/L。该方法不仅对ALP有很好的选择性，而且可以用来检测ALP的抑制剂原钒酸钠对ALP的抑制效果。利用这一性质，将吸光度值作为输出信号，还能构建如图4所示的IMPLICATION逻辑门和NOR逻辑门。7

图4. 利用2D-MOF和磷酸盐检测ALP以及构建逻辑门的原理图7

除了磷酸盐，王小宇等人还利用具有类过氧化物酶活性的Pt、Ru、Ir纳米颗粒构建比色型纳米酶传感器阵列，分别用于区分六种生物硫醇、九种蛋白质以及五种肿瘤细胞（如图5）。基于生物硫醇对过氧化物酶活性的抑制作用，该传感器阵列能够实现在5 μM至100 μM的范围内对六种生物硫醇进行区分，而且能够区分不同比例的混合样品。在FBS体系中成功区分了六种生物硫醇，验证了该传感器在实际样品检测中的识别能力。由于蛋白质能够与纳米酶表面相互作用而改变纳米酶催化反应的速率，该传感器阵列能够实现在20 nM至2000 nM的范围内对九种蛋白质进行区分，而且当蛋白质存在于尿液样品中时，该传感器阵列依然能够实现蛋白质的识别。由于细胞的裂解液中含有蛋白质、生物硫醇等生物基质，且不同的组织的细胞裂解液中所含的生物基质的种类和含量不同，因此还能够用该传感器阵列对五种肿瘤细胞进行区分。8

图5. 金属纳米颗粒构建的纳米酶传感器阵列用于生物硫醇、蛋白质和肿瘤细胞检测的示意图8

类似的，林俊淑等人合成了金相关的合金AuPt、AuPd和AuPtRu，这三种合金都具有比金纳米颗粒更优异的类过氧化物酶活性，基于生物硫醇对过氧化物酶活性的抑制，以这三种合金构建了比色型纳米酶传感器阵列，用于区分六种生物硫醇（图6）。该传感器阵列能够实现在1 μM至50 μM的范围内对六种生物硫醇进行区分，而且能够区分不同比例的混合样品，还能够在FBS存在条件下成功区分低浓度的六种生物硫醇。9

图6. AuPt、AuPd和AuPtRu构建的比色型纳米酶传感器阵列检测六种生物硫醇的示意图9

除了磷酸盐、生物分子、细胞之外，魏辉教授课题组还利用纳米酶传感器阵列进行农药的检测。朱昀瑶等人合成了石墨烯基纳米酶氮掺杂石墨烯（NG）和氮硫双掺杂石墨烯（NSG），与氧化石墨烯（GO）一起构建了比色型纳米酶传感器阵列。这三种石墨烯基纳米酶都具有类过氧化物酶活性。由于芳香类农药能够通过π-π作用吸附在石墨烯基纳米酶上，抑制其类过氧化物酶活性，因此利用该传感器阵列能够实现对五种芳香类农药的检测（图7）。该传感器阵列能够在5-500 μM浓度范围内区分五种农药的种类，还能够区分不同比例的农药混合物。在实际应用方面，该传感器阵列能够对土壤样品中的五种农药进行鉴别。10

图7. NG、GO、NSG构建的比色型纳米酶传感器阵列检测五种芳香类农药的原理图10

综合上述成果，纳米酶传感器阵列结合了纳米酶与传感器阵列的优势，材料易于制备，成本低廉，活性优异，通过简单的比色法或荧光法就能进行检测，而且能够对多种分析物同时鉴别，大大提高了检测效率。下一步的研究包括检测更多其他种类的分析物、提高纳米酶传感器阵列的特异性等等。11

参考文献：

(1) Askim, J. R.; Mahmoudi, M.; Suslick, K. S. Optical sensor arrays for chemical sensing: the optoelectronic nose. Chem. Soc. Rev. 2013, 42, 8649-8682.

(2) Diehl, K. L.; Anslyn, E. V. Array sensing using optical methods for detection of chemical and biological hazards. Chem. Soc. Rev. 2013, 42, 8596-8611.

(3) Li, Z.; Askim, J. R.; Suslick, K. S. The optoelectronic nose: Colorimetric and fluorometric sensor arrays. Chem. Rev. 2019, 119, 231-292.

(4) Li, X.; Wen, F.; Creran, B.; Jeong, Y.; Zhang, X.; Rotello, V. M. Colorimetric protein sensing using catalytically amplified sensor arrays. Small 2012, 8, 3589-3592.

(5) Qin, L.; Wang, X.; Liu, Y.; Wei, H. 2D-metal-organic-framework-nanozyme sensor arrays for probing phosphates and their enzymatic hydrolysis. Anal. Chem. 2018, 90, 9983-9989.

(6) Wang, X.; Qin, L.; Lin, M.; Xing, H.; Wei, H. Fluorescent graphitic carbon nitride-based nanozymes with peroxidase-like activities for ratiometric biosensing. Anal. Chem. 2019, 91, 10648-10656.

(7) Wang, X.; Jiang, X.; Wei, H. Phosphates-responsive 2D-Metal─Organic-Framework-Nanozymes for Colorimetric Detection of Alkaline Phosphatase. Journal of Materials Chemistry B 2020. DOI: 10.1039/C9TB02542A

(8) Wang, X.; Qin, L.; Zhou, M.; Lou, Z.; Wei, H. Nanozyme sensor arrays for detecting versatile analytes from small molecules to proteins and cells. Anal. Chem. 2018, 90, 11696-11702.

(9) Lin, J.; Wang, Q.; Wang, X.; Zhu, Y.; Zhou, X.; Wei, H. Gold alloy-based nanozyme sensor arrays for biothiol detection. Analyst 2020. DOI: 10.1039/D0AN00451K

(10) Zhu, Y.; Wu, J.; Han, L.; Wang, X.; Li, W.; Guo, H.; Wei, H. Nanozyme sensor arrays based on heteroatom-doped graphene for detecting pesticides. Anal. Chem. 2020. DOI: 10.1021/acs.analchem.9b05110

(11) Wang, X.; Wei, H. Peroxidase-like nanozyme sensing arrays for versatile analytes. J. Nanopart. Res. 2020, 22, 22.

文|朱昀瑶

审阅|王小宇、朱昀瑶

编辑|徐庚辰

原文链接：

https://dx.doi.org/10.1021/acs.analchem.9b05110

本文首发于“纳米酶Nanozymes”公众号，2020年5月6日